Родом из ликаонского города Листры, в Малой Азии. Был любимым учеником и неотлучным спутником св. апостола Павла, разделявший с ним труды апостольства, узы и страдания. Вместе со своим учителем проповедовал Христа в Ефесе, Коринфе, различных городах Македонии, Италии и Испании.
Был первым епископом Ефесской церкви и запечатлел свое служение мученической смертью. Видя однажды скверные, постыдные пляски идолопоклонников, святой открыто обличил их нечестие. Разъяренные язычники жестоко избили апостола, попирали его ногами, влачили по городу и замучили до смерти.
Во время своего епископства св. Тимофей получил от св. апостола Павла два послания пастырского характера. В 356 г. честные мощи св. апостола Тимофея были перенесены из Ефеса в Константинополь св. великомучеником Артемием.
Благости научився и трезвяся во всех, благою совестию священнолепно оболкся, почерпл еси от сосуда избранного неизреченная и, веру соблюд, равное течение совершил еси, апостоле Тимофее, моли Христа Бога спастися душам нашим.